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Macrophage tuer des pathogènes bactériens et fongiques n’est pas inhibée par l’accumulation intracellulaire intense de l’antibiotique lipoprotéique Oritavancin

April 2, 2020 0 Comment

La fonction effectrice phagocytaire intacte est fondamentale pour la défense contre les agents pathogènes microbiens Des inquiétudes ont été soulevées concernant le potentiel d’accumulation de certains agents, y compris les antibiotiques amphiphiles cationiques, dans les macrophages, provoquant un trouble du stockage des lipides mixtes. les lignées cellulaires de macrophages HL-; RAW pour tuer Staphylococcus aureus Gram positif archétypal, Acinetobacter baumannii Gram négatif, et Candida albicans pathogènes fongiques a été testé après l’exposition des macrophages à l’antibiotique lipoglycopeptide oritavancin Oritavancin n’a pas affecté la mort de C albicans, mais nettement augmenté de S aureus à la fois par les deux macrophages Oritavancin réduit de façon modeste la destruction de A baumannii par les cellules HL mais pas par les cellules RAW Ainsi, la destruction des microbes par les macrophages reste intacte malgré une accumulation intracellulaire substantielle avec un antibiotique lipoglycopeptidique.

La fonction effectrice phagocytaire intacte est fondamentale pour la défense contre les agents pathogènes microbiens, comme le coccus à Gram positif Staphylococcus aureus, le bacille Gram négatif Acinetobacter baumannii et le pathogène fongique Candida albicans Bien que de nombreuses études antérieures se soient concentrées sur le rôle des neutrophiles, l’importance des macrophages dans la défense de l’hôte contre de tels pathogènes n’a été décrite que récemment [, -] Ces études concordent avec la littérature plus ancienne confirmant la clairance précoce et marquée des pathogènes extracellulaires, tels que C albicans, quelques minutes après l’infection sanguine par les phagocytes. dans le système réticuloendothélial des mammifères, y compris les rongeurs, les lagomorphes, les chiens et les humains Un mécanisme putatif par lequel la fonction microbicide des macrophages peut être inhibée est l’accumulation de dépôts riches en lipides ou en hydrates de carbone dans les phagocytes. Oritavancin est un lipoglycopeptite expérimental de l’antibiotique avec activité anti-S aureus puissante Oritavancin s’accumule nettement dans les macrophages, où il provoque le dépôt de structures lamellaires concentriques et de matériaux finement granulaires et autres matériaux, souvent dans des vésicules géantes, compatibles avec un trouble de stockage des lipides mixtes. si l’accumulation intracellulaire marquée de l’oritavancine altère la destruction des microbes, la destruction des macrophages en présence ou en absence d’oritavancine a été testée contre S aureus, ainsi que les organismes contre lesquels le médicament n’a aucune activité, y compris les albicans et les cellules murines. Les cellules macrophages de l’American Type Culture Collection de Rockville, MD, ont été testées car elles sont capables de tuer les microbes après différenciation. Les cellules ont été cultivées à ° C en% CO à Roswell Park Memorial Institute Irvine Scientific, Santa Ana Californie, avec% de sérum fœtal bovin,% de pénicilline, de streptomycine et de glutamine Gemini BioProducts, et μmol / L β-mercaptoéthanol Sigma-Aldrich, St Louis, MO Les cellules HL ont été différenciées en macrophages par jours de croissance en présence de μmol / L activateur tissulaire du plasminogène recombinant Les cellules RAW ont été activées par des jours d’exposition à nmol / L Phorbol -myristate -acétate Sigma-Aldrich Les macrophages activés HL et RAW ont été récoltés après raclage avec des grattoirs BD Falcon Fischer Scientific L’accumulation cellulaire d’oritavancine a été confirmée pour la première fois dans des cellules HL à une concentration extracellulaire fixe μg / mL suivant des procédures publiées ailleurs. la concentration a été choisie parce qu’elle reflète également la concentration sérique de médicament libre maximale prévue obtenue par l’administration d’une dose clinique mg du médicament et se rapproche de la limite de solubilité de l’oritavancine à pH physiologique dans le milieu de croissance. L’oritavancine marquée au C] a été lavée fois dans une solution saline tamponnée au phosphate glacée, recueillie par raclage dans wa Le taux apparent de concentration cellulaire à extracellulaire a été calculé en utilisant un facteur de conversion de μL de volume cellulaire par milligramme de protéine cellulaire Oritavancin accumulé substantiellement dans les cellules HL -, atteignant des concentrations intracellulaires – Pli au-dessus des concentrations extracellulaires après heures d’incubation Figure Cette valeur est similaire à ce qui a été observé précédemment pour les macrophages J murins , ce qui suggère qu’il correspond à une propriété intrinsèque de l’oritavancine dans les macrophages

Figure Vue largeDownload slideInfluence du temps sur l’accumulation cellulaire d’oritavancine dans les cellules HL- Cinétique de l’accumulation cellulaire d’oritavancine μg / mL dans les cellules HL- milieu de culture complet,% sérum bovin fœtal Les résultats sont présentés comme le rapport de concentration cellulaire apparent à extracellulaire sont des moyennes ± écarts-types d’expériences indépendantes Abréviation: Cc / Ce, ratio de concentration cellulaire à extracellulaireFigure Voir grandDownload slideInfluence du temps sur l’accumulation cellulaire d’oritavancine dans les cellules HL- Cinétique de l’accumulation cellulaire d’oritavancine μg / mL dans les cellules HL- complète milieu de culture,% sérum bovin fœtal Les résultats sont présentés comme le rapport de concentration cellulaire à extracellulaire apparent. Les données sont des moyennes ± écarts-types d’expériences indépendantes. Abréviation: Cc / Ce, rapport de concentration cellulaire à extracellulaire ont été chargés d’oritavancine μg / mL pendant des heures; en tant que contrôle négatif, d’autres cellules ont été chargées avec de l’azithromycine à μg / mL, comme décrit ailleurs Après chargement du médicament, les cellules adhérentes ont été raclées et rincées dans du HBSS Solution saline équilibrée HBSS comme contrôle positif pour supprimer la destruction des microbes par les macrophages. Après avoir inhibé la production de superoxyde, certaines cellules ont été exposées au DPI de diphénylène iodonium nmol / L pendant une heure avant la récolte des cellules Pour tester la destruction des macrophages, l’isolat clinique résistant à la méthicilline SAC de souche S aureus et l’isolat clinique de baumannii HUMC résistant au carbapénème ont été testés. cultivé pendant une nuit dans du bouillon de soja trypsique à ° C, et l’isolat sanguin clinique C albicans a été cultivé pendant une nuit à ° C dans la levure peptone dextrose YPD Les cultures d’une nuit ont été passées et les organismes cultivés jusqu’à mi-log phase avant d’être utilisés dans l’essai de destruction. était basé sur une modification d’une méthode utilisée ailleurs En bref, les macrophages ont été raclés et rincés dans HBSS comme ci-dessus. Sur la base d’études pilotes, des cellules HL ont été cultivées dans un rapport de macrophages à microbes, et les cellules RAW ont été cultivées selon un rapport: après une incubation d’une heure, les cellules HL ont été cultivées dans des tubes en polystyrène. Les unités CFU des tubes co-cultivés ont été comparées aux CFU de tubes témoin de croissance contenant uniquement des microbes sans macrophages. Le pourcentage de mortalité a été calculé Les macrophages HL et RAW ont tué tous les pathogènes testés La destruction des albicanes par les macrophages n’a pas été affectée par l’oritavancine, alors que la destruction de S aureus a été considérablement améliorée hémorroïdes. Figure A Oritavancine Un baumannii par les cellules HL – médiane [intervalle interquartile IQR] tuant =% [% -%] vs% [% -%], P & lt; mais pas par les cellules RAW médian [IQR] tuer =% [% -%] vs% [% -%], P = DPI significativement réduit la destruction de tous les organismes par les cellules HL et RAW, y compris celles comparées aux macrophages préchargés d’oritavancine Figure B

Les macrophages de souris HL-A ou de souris RAW B ont été co-cultivés avec Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, ou Candida albicans avec ou sans pré-exposition à l’oritavancine, l’azithromycine ou le diphénylène iodonium DPI; un inhibiteur de superoxyde Les intervalles médian et interquartile sont montrés à partir de chacun des échantillons, réalisés en double à partir d’expériences séparées * P & lt; La macrophages humaines HL-A ou de souris RAW B ont été co-cultivées avec Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, ou Candida albicans avec ou sans pré-exposition à l’oritavancine l’azithromycine ou le diphénylène iodonium DPI; un inhibiteur de superoxyde Les intervalles médian et interquartile sont montrés à partir de chacun des échantillons, réalisés en double à partir d’expériences séparées * P & lt; Ainsi, contrairement au DPI, qui supprime la production d’intermédiaires réactifs de l’oxygène et qui inhibe la destruction des macrophages par tous les agents pathogènes extracellulaires, la destruction de C albicans ou de A baumannii demeure intacte après le chargement de macrophages avec des taux importants d’oritavancine. ou azithromycine Bien que l’oritavancine ait induit une réduction modeste de la destruction de A baumannii par les cellules HL, la destruction était similaire à celle qui a suivi l’azithromycine; Ces données indiquent que l’accumulation de lipoglycopeptides dans les macrophages ne correspond pas nécessairement à un dysfonctionnement de la destruction des microbes par les macrophages, et rassurent que l’accumulation d’oritavancine n’empêche pas la destruction phagocytaire de ces cellules. pathogènes clés

Remarques

Aide financière

Ce travail a été soutenu par NIH / NIAID R accorde AI et AI et la subvention F du Fonds belge de la Recherche Scientifique Médicale, en plus du financement de The Medicines Company

Supplément de parrainage

Cet article a été publié dans le cadre d’un supplément intitulé “Oritavancin pour le traitement des infections gram-positives graves”, parrainé par The Medicines Company

Conflits d’intérêts potentiels

FVB a reçu des subventions de recherche de la Medicines Company et RibX, son institut de recherche a été payé des frais de consultation de Targanta, et il siège au conseil de RibX et Morphochem PMT a reçu des subventions de Medicines Company et Cerexa, son institut de recherche a été payé Il a reçu des subventions de recherche de GlaxoSmithKline GSK et AstraZeneca BS a reçu des subventions de recherche ou des contrats de la Medicines Company, Pfizer, Cubist et GSK, son institut a été payé des frais de consultation pour ses activités de consultation. de GSK, Pfizer, Achaogen, Meiji, la Medicines Company, et il a reçu des frais de conférence de Cubist, AstraZeneca et Achaogen Tous les autres auteurs ne signalent aucun conflit potentiel Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits potentiels Conflits d’intérêts considérer pertinent au contenu du manuscrit ont été divulgués